Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode amplifikasi enzimatis urutan DNA tertentu secara invitro. Perbedaannya dengan kloning (yang menggunakan cara introduksi DNA ke dalam sel inang bakteri, fage atau ragi) adalah, bahwa replikasi DNA pada PCR berlangsung dalam tabung reaksi, sehingga dinamakan ”kloning molekul bebas sel” (cell free molecular cloning). PCR dapat melakukan amplifikasi urutan DNA spesifik sampai jutaan kali lipat melalui prosedur yang sangat sederhana. PCR merupakan teknik potensial yang ramifikasinya dalam Biologi Molekular masih terus berkembang (Walker and Gingold, 1993).

1. Siklus PCR.

Proses PCR memerlukan pengulang-ulangan suatu seri terdiri dari tiga tahap yang disebut satu siklus PCR, yaitu : 1) tahap denaturasi,  yaitu cetakan DNA beruntai ganda (double strand) diubah menjadi untai tunggal (single strand), 2) tahap annealing, yaitu pembentukan hibrida antara dua buah primer oligonukleotida dengan sebuah molekul cetakan untai tunggal dan 3) tahap pemanjangan primer, yaitu pemanjangan primer secara enzimatis menghasilkan kopi target yang berfungsi sebagai cetakan dalam siklus berikutnya

Daerah target yang berupa DNA untai ganda dipisahkan secara denaturasi termal pada suhu 94-960C menjadi untai DNA tunggal. Temperatur kemudian diturunkan agar primer menempel pada daerah spesifik DNA target untai tunggal. Suhu untuk annealing tergantung pada Tm (melting temperature) dari hibrida  antara primer-cetakan. Pada umumnya seseorang menggunakan  program software untuk memprediksi Tm yaitu berdasarkan urutan primer dan konsentrasinya, serta konsentrasi garam secara keseluruhan. Suhu annealing terbaik ditentukan dengan optimasi. DNA polimerase kemudian digunakan untuk pemanjangan primer dengan adanya dNTP dan buffer yang cocok. Pemanjangan  primer terjadi pada suhu 720C untuk kebanyakan cetakan. Dengan cara demikian akan dihasilkan duplikat daerah target DNA untai ganda. Begitu siklus berlangsung, maka cetakan asli maupun kopi terget (hasil amplifikasi) berperan sebagai substrat untuk reaksi denaturasi, annealing dan pemanjangan primer. Proses siklus ini diulang sebanyak 20-40 kali sampai diperoleh DNA target untai ganda yang dapat diamati secara jelas pada elektroforesis gel agarosa (Newton and Graham, 1994).

Jumlah siklus optimum tergantung pada kadar DNA target. Jumlah siklus yang terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan kompleksitas produk non spesifik sedangkan jumlah siklus  yang rendah akan didapat perolehan  yang kecil.

Jika siklus diulang beberapa kali, maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial yang hasil akhirnya (produk PCR, berupa untai ganda) dapat dirumuskan sebagai (2n-2n)X, dengan n adalah jumlah siklus, 2n adalah hasil pertama yang diperoleh setelah siklus pertama dan hasil kedua yang diperoleh setelah siklus ke dua dengan panjang tidak tertentu, dan X adalah jumlah kopi cetakan DNA (Newton and Graham, 1994). Dengan demikian satu molekul DNA yang diamplifikasi sebanyak 20 siklus akan menghasilkan sekitar (220-40) produk PCR yang dapat diamati secara jelas berupa pita DNA pada elektroforesis gel agarosa. Banyaknya siklus yang disarankan untuk masing-masing jumlah kopi atau molekul dapat dilihat pada tabel .

Tabel Hubungan jumlah molekul cetakan dan jumlah siklus PCR

Jumlah molekul cetakan Jumlah siklus
3,0.105 25-30
1,5.104 30-35
1,0.103 35-40
50 40-45

(Innis and Gelfand, 1990)

2. Primer PCR.

Primer PCR adalah oligodeoksiribonukleotida pendek, atau oligomer, yang didesain komplemen dengan urutan ujung target produk PCR. DNA sintetik ini biasanya sepanjang 15-25 nukleotida dan memilki kandungan G+C minimal sebanyak 50%. Primer dapat berupa urutan DNA yang telah diketahui (primer spesifik) atau urutan DNA turunan yang diprediksi dari urutan asam amino protein yang disandi, dinamakan degenerate primer.

Masing-masing dari dua buah primer tersebut komplemen dengan untai yang berbeda pada urutan target beruntai ganda, maka kedua primer tersebut tidak ada kaitan satu sama lain. Urutan primer harus dijaga agar tidak membentuk struktur dupleks atau hairpin loop antar dirinya sendiri.

Ujung 3’ primer harus cocok atau komplemen dengan target agar polimerisasi berjalan efisien. Ujung 5’ primer dapat memiliki urutan yang tidak komplemen dengan target, sehingga mengandung sisi enzim restriksi atau sisi promotor yang akan tertempel pada produk PCR.

3. Enzim –enzim untuk PCR.

Amplifikasi urutan DNA tertentu dengan PCR memerlukan DNA polimerase yang stabil terhadap panas dan primer. Polimerase yang digunakan dalam PCR antara lain Taq, Vent, dan Pfu, yang dihasilkan bakteri termofilik secara berurutan Thermus aquaticus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus. Semua polimerase tersebut stabil pada suhu >950C (suhu denaturasi DNA), dan beraktifitas pada suhu 700C (Baktir, 2000).

DNA polimerase Ampli Taq memerlukan ion magnesium sebagai kofaktor, dan mengkatalisis reaksi pemanjangan suatu primer yang menempel pada cetakan pada 720C. Keempat dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dipakai sesuai dengan aturan pasangan basa komplemen untuk memperpanjang primer, sehingga terjadi pengkopian urutan target (Baktir, 2000).

4.  Kofaktor ion logam.

Magnesium klorida merupakan kofaktor bagi DNA polimerase yang dipakai dalam PCR, dan kadarnya harus dioptimasi untuk setiap pasangan primer/cetakan. Kebanyakan komponen reaksi mengikat ion magnesium, termasuk primer, cetakan, produk PCR dan dNTP. Kadar dNTP dalam campuran reaksi cukup tinggi, dimana kemampuannya mengikat magnesium sebesar 1:1. Karena keberadaan ion magnesium bebas sebagai kofaktor enzim sangat penting dalam PCR, maka total ion magnesium harus melebihi total dNTP. Khusus dalam proses optimasi awal MgCl2 1,5 mM ditambahkan dalam campuran reaksi PCR dengan adanya 0,8 mM dNTP total, maka ion magnesium bebas yang tinggal dalam larutan (untuk DNA polimerase) adalah 0,7 mM (Baktir, 2000).

5. Bufer/garam.

Bufer PCR untuk DNA polimerase terdiri dari 50 mM KCl dan 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 pada suhu kamar. Bufer ini memberikan kekuatan ion dan kapasitas bufer yang diperlukan selama reaksi.

Penambahan KCl sampai kadar 50 mM diperlukan untuk memudahkan proses annealing. Tetapi kadar KCl >50 mM dan NaCl=50 mM akan menghambat aktivitas DNA polimerase Taq.

1 Comment (+add yours?)

  1. rio
    Sep 04, 2012 @ 14:34:27

    sumbernya mana ya mbakk?? materinya baguss

    Reply

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: